介紹
在生物制劑的開發(fā)中，產(chǎn)生穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞系有著廣泛的應(yīng)用，如治療性抗體，或?yàn)榕囵B(yǎng)皿中的疾病模型創(chuàng)建CRISPR工程細(xì)胞。雖然對(duì)工程細(xì)胞系的需求有所增加，但單克隆細(xì)胞系的生產(chǎn)仍然受到當(dāng)前單細(xì)胞分選和分配技術(shù)的限制。
本文，我們對(duì)比了傳統(tǒng)技術(shù)的局限性與新技術(shù)（SCP4000, AURE.Inc）的特點(diǎn)，新技術(shù)擁有高達(dá)640個(gè)獨(dú)立可控制的噴嘴，可以分析、分選和分配單個(gè)細(xì)胞到96孔或384孔板上，具有高效，高活力和高生長(zhǎng)率。
此外，由于新技術(shù)在細(xì)胞分離的過程中對(duì)細(xì)胞幾乎無損傷，除了永生化細(xì)胞系(例如CHO)，新技術(shù)還支持更敏感的細(xì)胞都可以在無菌環(huán)境下分離并培養(yǎng)成單克隆細(xì)胞系。
單細(xì)胞克隆技術(shù)現(xiàn)狀
傳統(tǒng)的方法，如激光捕獲顯微解剖(LCM)和微操作器集落挑選，可以分離單細(xì)胞，但是，它們的工作流程與活細(xì)胞不兼容，并且通量非常低。
使用傳統(tǒng)的技術(shù)，比如有限稀釋，是一種首選的解決方案，前期資源需求最小，對(duì)細(xì)胞的處理也很溫和。
然而，有限稀釋是低效的，不能積極選擇產(chǎn)生蛋白質(zhì)的細(xì)胞或避免死細(xì)胞，導(dǎo)致多余的下游成像工作。
流式細(xì)胞分選(FACS)方法允許以更高的通量分析和分選特定細(xì)胞。
然而，傳統(tǒng)的基于液滴的細(xì)胞分選機(jī)制和流體系統(tǒng)將細(xì)胞暴露在巨大的剪切應(yīng)力和大而快速的壓力變化中，這些壓力變化可能會(huì)殺死或損傷細(xì)胞，這減少了細(xì)胞菌落的生長(zhǎng)。樣品間的污染也是傳統(tǒng)FACS的一個(gè)主要問題，因?yàn)榱黧w管線不是一次性的，必須用化學(xué)方法清洗。
基于單流道的微流控技術(shù)的細(xì)胞分選方法改善了高剪切力對(duì)于細(xì)胞的損失，但是這類技術(shù)對(duì)單細(xì)胞液滴的控制要求很高，存在較大的液滴打偏概率，導(dǎo)致單細(xì)胞率低。
此外，由于單流道單噴嘴的設(shè)計(jì)，當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞懸液粘稠，碎片比較多，或細(xì)胞黏連嚴(yán)重的情況，芯片會(huì)出現(xiàn)堵塞導(dǎo)致分選不成功。
SCP4000的優(yōu)勢(shì)
為了解決以上問題，新技術(shù)（SCP4000，AURE, Inc)中的核心部件—640個(gè)噴嘴集成到1個(gè)芯片中，解決了同類儀器因?yàn)榧?xì)胞堵塞造成單細(xì)胞分選失敗的問題，并且完全實(shí)現(xiàn)整個(gè)儀器的無管路式設(shè)計(jì)，樣本間零交叉污染；(Pic 1)
Pic 1. 上海傲睿研發(fā)的SCP4000外觀圖以及高通量的生物芯片
基于高清成像及人工智能算法，可精準(zhǔn)自動(dòng)區(qū)分單細(xì)胞、懸液中碎片、多細(xì)胞。
此外還可根據(jù)單細(xì)胞的形貌，挑選優(yōu)質(zhì)的單細(xì)胞進(jìn)行分選，從而提升單克隆形成率。(Pic 2)
Pic 2. 上海傲睿科技自主研發(fā)的AI細(xì)胞識(shí)別算法，
能夠根據(jù)客戶的需求篩選出優(yōu)質(zhì)的單細(xì)胞
芯片在送到客戶之前，采用輻照滅菌，確保給細(xì)胞提供安全，無菌的環(huán)境。插拔式的安裝設(shè)計(jì)，客戶一步安裝到位。(Pic 3)
Pic 3. SCP4000的生物芯片安裝簡(jiǎn)易，一步到位。
結(jié)果
單克隆分選的準(zhǔn)確性
為了測(cè)試SCP4000準(zhǔn)確性，我們進(jìn)行了中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的分選，這是常用于生物制劑的生產(chǎn)細(xì)胞。
在分選之前，我們對(duì)于兩個(gè)穩(wěn)定的CHO細(xì)胞池進(jìn)行紅綠熒光染色，染色后混合均勻上樣至芯片中進(jìn)行單克隆分選。SCP4000將單個(gè)細(xì)胞分選到96孔板后（含有培養(yǎng)基）。
在經(jīng)歷2h后的細(xì)胞沉降，采用CELL METRIC（ADVANCED, Inc）細(xì)胞成像儀進(jìn)行拍照，確認(rèn)D0的單細(xì)胞孔。
然后在37°C, 5% CO2下孵育21天后，采用FACS分析每個(gè)單克隆團(tuán)的熒光信號(hào)。
本次測(cè)試了共553個(gè)CHO細(xì)胞單克隆團(tuán)，其中判定為綠熒光信號(hào)的孔數(shù)為265個(gè)，判定為紅熒光信號(hào)的孔數(shù)為288個(gè)，判定同時(shí)有紅綠熒光信號(hào)的孔數(shù)為0個(gè)。根據(jù)下圖的公式，計(jì)算得到的單克隆保證綠為99.5%，滿足FDA的要求。(Figure 1)
Figure 1. SCP4000分選的單克隆保證率
(a). 采用SCP4000分選得到的單克隆孔，培養(yǎng)21天后用FACS測(cè)量熒光信號(hào)。553個(gè)CHO細(xì)胞單克隆團(tuán)，其中判定為綠熒光信號(hào)的孔數(shù)為265個(gè)，判定為紅熒光信號(hào)的孔數(shù)為288個(gè)，判定同時(shí)有紅綠熒光信號(hào)的孔數(shù)為0個(gè)。
(b). 根據(jù)計(jì)算公式，可以算出采用SCP4000得到的單克隆保證率為99.5%，滿足FDA的要求。
單細(xì)胞分選效率及單克隆生長(zhǎng)率
為了測(cè)試SCP4000分選的效率和克隆生長(zhǎng)率，我們選取了轉(zhuǎn)染分子后的項(xiàng)目CHO細(xì)胞，一共4個(gè)細(xì)胞池（pool ID分別為28,FB,FD,FE），采用SCP4000對(duì)每個(gè)細(xì)胞池分選5塊96孔板。
并且，對(duì)于細(xì)胞池28，采用有限稀釋法鋪2塊96孔板作為對(duì)照組。上樣細(xì)胞的buffer為Sigma EX-CELL CHO。分選完成后，經(jīng)過2h的細(xì)胞沉降，采用CELL METRIC(ADVANCED, Inc)孔板成像儀器進(jìn)行拍照，確認(rèn)D0的單細(xì)胞率。然后在37°C, 5% CO2下孵育18天，分別在D1，D2，D7，D18天確認(rèn)細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)狀態(tài)。(Pic 4)
Pic 4. 采用SCP4000進(jìn)行單克隆分選，
CELL METRIC進(jìn)行單細(xì)胞孔板成像
對(duì)于單塊96孔板的分選時(shí)長(zhǎng)，SCP4000可以做到2min/96孔板分選。對(duì)于D0的單細(xì)胞接種率，我們對(duì)每個(gè)pool隨機(jī)挑選了一塊孔板進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到平均的單細(xì)胞率約90%(Figure 2)。
對(duì)于D18的單克隆生長(zhǎng)情況，我們統(tǒng)計(jì)了包括有限稀釋法在內(nèi)的22塊孔板的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，其中SCP4000分選的10塊孔板，單克隆獲得率平均為77.63%，有限稀釋法的2塊孔板，單克隆獲得率僅為11.58%(Figure 3)。并且，采用SCP4000分選得到的細(xì)胞團(tuán)生長(zhǎng)狀態(tài)良好，匯合度高。(Pic 5)
Figure2. SCP4000單細(xì)胞分選效率與單細(xì)胞率
(a).不同pool的細(xì)胞，SCP4000分選每塊孔板的平均時(shí)間in。
(b). 對(duì)于不同pool的細(xì)胞，隨機(jī)選取一塊孔板進(jìn)行單細(xì)胞率統(tǒng)計(jì)。其中統(tǒng)計(jì)總數(shù)在96孔的基礎(chǔ)上，減去了參考孔A1，以及邊緣孔，幽靈孔。得到的平均單克隆約90%。
Figure 3. SCP4000單細(xì)胞分選的單克隆獲得率
Figure 3. SCP4000單細(xì)胞分選的單克隆獲得率：對(duì)于CHO項(xiàng)目細(xì)胞的2個(gè)細(xì)胞池，采用SCP4000分選得到的單克隆團(tuán)數(shù)量平均值大于70個(gè)，單克隆獲得率約77.63%，約為有限稀釋法的6.6倍（以pool為例）
Pic 5. 采用SCP4000分選單克隆的孔板
在D18細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)
結(jié)論
目前市場(chǎng)上的其他技術(shù)很難同時(shí)做到，高效并且溫和的篩選出優(yōu)質(zhì)的單細(xì)胞到96或384孔板中，上海傲睿科技有限公司自研的SCP4000基于高達(dá)640可獨(dú)立控制的噴嘴，配合AI識(shí)別單細(xì)胞算法，可以做到在2min分選1塊96孔板，并且分選的過程柔和對(duì)細(xì)胞無剪切力，使得在D18客戶可以達(dá)到77%的單克隆獲得率，是有限稀釋發(fā)的6.6倍，大大提高了細(xì)胞株開發(fā)的效率。
