作為一種潛在的、可替代動物模型的前沿技術，3D細胞體外模型（包括但不限于類器官）近年來受到行業內廣泛的關注，包括腸、肝、胃、胰腺、腦、心臟等一系列類器官模型被成功建立，用于研究生物發育、疾病機制及藥物研發等領域中。
常見的類器官包括成體干細胞（ASCs）和多能干細胞（PSCs）兩種系統。其中PSC系統遺傳背景清晰、明確的分化方向及、更廣泛的適應性及基因工程更易結合等優勢，但周期長、過程復雜、投入大等問題。
相對地，ASCs系統則來源于具有一定再生能力的類器官（尤其上皮類器官），常用于構建正常/癌性類器官，具有周期短、易獲取、具有天然腫瘤微環境（TME）等優點。本文將圍繞ASC系統構建類器官的工程學方法進行簡單的總結。
常規的ASC系統一般基于matrigel包埋后加入特殊培基進行體外培養，目前這些過程主要依賴于有經驗的研發人員手工操作。行業上游的設備供應商對上述環節也做了各種各樣的嘗試，以期望提高自動化程度，提高實驗批次間可靠性、穩定性。
圖1 基于ECM包埋法構建類器官模型
◆ 基于Nanowell技術
構建均一性細胞球
利用工程學手段構建數百微米的nanowell，配合特殊的超低吸附表面修飾或水凝膠材料，使得細胞懸液沉底后形成3D細胞球。
諸如Corning、Sartorius等廠家均提供類似產品（圖2），其顯著優勢是成球通量顯著上升、信噪比提高明顯[1]。
最早這種方案主要用于細胞系成球培養（Spheroids），目前也有團隊嘗試用該方法構建類器官并進行懸浮培養（Matrigel<2%）[2]。
當然，由于構建的Nanowell尺寸小，其表面張力較大，細胞懸液（或培基）不容易滲入微孔中，所以一般廠家會推薦前處理方案，比如用表面活性劑對nanowell進行預處理，離心后移除表面活性劑，用培基潤洗后重新加入細胞懸液等。
圖2 各種商業化nanowell耗材
◆ 基于擠出式3D打印
構建均一性細胞球
由于經典的類器官培養本身是將細胞懸液與matrigel（細胞外基質材料）混合后用移液槍分配到孔板里，所以最早出現自動化設備其實也是基于類似原理的擠出式方案（圖3）。
圖3 商業化擠出式打印設備
作為較早出現的類器官自動化方案，擠出式打印在一定程度上完成了模型制備過程的標準化，這種傳統的類器官構建方案在一定程度上幫忙研究者更好理解諸如腫瘤發生發展機制或者是藥物殺傷機制等。
隨著科學研究的進一步推進，這種傳統的類器官模型的局限性也日益突出。以腫瘤類器官為例，由于傳統構建方式僅僅保留了腫瘤細胞，而喪失了體內特有的微環境，導致體外研究觀察的腫瘤發生發展與體內存在著顯著差異，或者基于該傳統模型構建的藥物響應與臨床效果不一致等情況，限制了類器官技術的應用。因而，能夠在體外重建微環境的系統顯得愈加重要。
圖4 幾種體外重建類器官構建技術
◆ 基于微流控技術的
新型類器官解決方案
2024年8月，在Nature Review Cancer上剛剛發表了一篇重量級綜述 “Cancer organoids 2.0: modelling the complexity of the tumour immune microenvironment” ，總結了幾種新一代類器官模型構建方式，并就工程化體外重建免疫/腫瘤微環境對疾病建模、藥物研發、精準醫療的重要性進行詳細闡述[3]。
作者將構建體系分成兩大類，一種是基于工程學重建免疫微環境體系的解決方案，另一種是保留天然免疫微環境解決方案，前者適合大規模、標準化建模、高通量藥物篩選，后者由于前處理的不確定性以及樣本用量等原因，更適合小規模機制性研究（圖4）。
基于工程學方法重建具有免疫微環境體系的解決方案，行業內最著名的案例就是Xilis的MOS平臺技術。
2021年7月8日，生物科技初創公司Xilis宣布完成一項 7000 萬美元的A輪融資，用于進一步推進名為MicroOrganoSphere?（MOS）類器官技術平臺，為癌癥患者提供個體化的精準治療策略，并加速藥物發現和開發。
2022年，Xilis在《Cell Stem Cell》發表文章介紹該技術——基于液滴夾流構建類器官/3D細胞球微小反應體系，可在14天內對腫瘤病人來源的類器官完成構建-藥物篩選-治療方案建議的全流程（圖5）。
圖5 基于液滴夾流技術開發新一代類器官構建技術
與前代技術相比，其典型優勢是利用微流控技術將樣本進行類似“數字化”處理，形成微系統進行高通量培養，可改善傳統培養方案下不同細胞存在競爭抑制而導致評估偏倚，或缺乏免疫/腫瘤微環境對藥物效應的偏差[4]。
◆ 傲睿科技專利技術
提供獨特類器官解決方案
傲睿自主研發數字液滴技術是另一種新型微流控技術，具有微量上樣、高精度細胞操控的優點，可形成高通量、標準化3D體外模型構建（圖6）。
圖6 傲睿數字化液滴打印平臺BP4000系列
該系統支持體外免疫微環境重構，可將免疫細胞精確定位遞送到3D腫瘤類器官上，并精確控制細胞數量，用于研究類器官對藥物刺激效應，幫助研究者更快更高效找到表現優異的免疫藥物候選對象。
圖7 基于BP4000平臺構建人間皮瘤原代3D模型
圖8 利用BP4000高精度原位遞送CAR-T藥物至靶區
圖7是傲睿科技與某CAR-T藥物研發企業合作案例。通過BP4000系統，設定不同參數，可制備大小可控的、標準化、高通量的人間皮瘤原代3D模型，孔間一致性CV<10%。
經過6天培養，原位遞送CAR-T細胞藥物到腫瘤模型的靶區域，圖6中紅色箭頭標記為CAR-T細胞。
原位打印組別和手工加樣組別添加相同數量T細胞，原代打印可將CAR-T細胞精確定位到原代腫瘤球上，而手工添加CAR-T細胞則分散在整個孔里，因而靶區CAR-T細胞細胞幾乎不可見，可以預見手工加樣方式下真正參與殺傷的CAR-T細胞遠低于實驗預期。
經24小時加藥刺激后，可以觀察到原代打印測試組CAR-T增殖殺傷效果明顯優于手工添加組別。
傲睿科技研發BP4000系列產品還可幫助研究者構建其他復雜模型，如不同類型細胞團互作、結合MIMICUp系統研究靜態/動態免疫共培養、不同摻雜方式構建腫瘤微環境以及3D水平高通量藥物篩選等（圖9）。
圖9 BP4000系列產品輔助建模功能
引用文獻
[1] Antoni D, Burckel H, Josset E, and Noel G. (2015). Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. International journal of molecular sciences, 16(3), 5517-5527. doi:10.3390/ijms16035517.
[2] Tan Tao, et al. Low-viscosity matrix suspension culture for human colorectal epithelial organoids and tumoroids. Bio-protocol 12.8 (2022): e4394-e4394.
[3] Cancer organoids 2.0: modelling the complexity of the tumour immune microenvironmentNature Review Cancer,Volume 24 | August 2024 | 523–539
[4] Ding et al., Patient-derived micro-organospheres enable clinical precision oncology，2022, Cell Stem Cell 29, 1–13.
