在類器官培養(yǎng)領(lǐng)域，如何突破細(xì)胞增殖分化效率的瓶頸、優(yōu)化染色檢測的技術(shù)流程，始終是科研工作者攻關(guān)的重要方向。傲睿科技BP4000細(xì)胞球構(gòu)建平臺憑借前沿技術(shù)創(chuàng)新，在人結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)中開辟了新路徑，其技術(shù)價(jià)值已通過大量實(shí)踐得到驗(yàn)證。
以下是基于BP4000平臺的最新人結(jié)直腸癌類器官構(gòu)建實(shí)踐案例：
一、人結(jié)直腸癌類器官的構(gòu)建
1. 收集人腫瘤組織塊，放在 50 mL離心管中，每管含有45 mL冰預(yù)冷的adDMEM/F12（含100 U/mL penicillin-streptomycin，10 mM HEPES，1×GlutaMAX）。adDMEM/F12培養(yǎng)基中建議加入10 μM ROCK抑制劑（Y-27632），以提高細(xì)胞存活能力。將組織樣本保存在這種培養(yǎng)基中，置于4 °C，直至開始分離。
2. 在解剖顯微鏡下用手術(shù)剪刀或手術(shù)刀和鑷子盡可能去除非上皮成分。
3. 在10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，使用手術(shù)剪刀或手術(shù)刀將組織切成1-3 mm3的小塊，并轉(zhuǎn)移至15 mL離心管。
4. 按表1配置組織消化液，現(xiàn)用現(xiàn)配，37 ℃預(yù)熱。將組織消化液加入到含有組織碎塊的離心管中，放在37 ℃搖床上孵育。
表1：結(jié)直腸消化液配方示例
5. 當(dāng)混合物變得渾濁且剩余的組織碎片被破碎時(shí)，使用移液器上下吹打10-20 次，進(jìn)一步促進(jìn)組織破碎。從頂部加入10 mL adDMEM/F12培養(yǎng)基（含100 U/mL penicillin-streptomycin，10 mM HEPES，1×GlutaMAX），并在 4 ℃下以200 g離心5分鐘，對細(xì)胞進(jìn)行清洗。
6. 將沉淀重懸在10 mL adDMEM/F12培養(yǎng)基中（含100 U/mL penicillin-streptomycin，10 mM HEPES，1×GlutaMAX），并用70-100 μm細(xì)胞濾網(wǎng)進(jìn)行過濾。
7. 對重懸和過濾后的細(xì)胞進(jìn)行離心，在4°C下以200 g離心5分鐘。吸出上清液，將沉淀重懸在含70%基質(zhì)膠（Corning #356231）的類器官完全培養(yǎng)基中。用移液槍滴在24孔板底部，每孔50 μL。
8. 將接種好類器官的24孔板置于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育10分鐘，使基質(zhì)膠凝固。
9. 向每孔中小心加入500 μL類器官完全培養(yǎng)基，將24孔板置于37℃、5% CO2加濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
10. 每2-3天更換一次培養(yǎng)基，從各孔中小心吸出培養(yǎng)基，然后加入新鮮的預(yù)熱培養(yǎng)基。培養(yǎng)5-7天即可長出結(jié)直腸癌類器官。
二、打印前的準(zhǔn)備
1. 按表1推薦的量在需要打印的孔板中預(yù)鋪70%的鋪基質(zhì)膠（adDMEM/F12稀釋），并在周圍的空白孔中添加無菌水以保證整塊板子的濕度。37℃培養(yǎng)箱中孵育45-60分鐘，使基質(zhì)膠凝固。提前半小時(shí)將加濕器打開，使超凈臺中的濕度維持在70-80%。
表1：不同孔板中鋪基質(zhì)膠的量
2. 提前半小時(shí)將加濕器打開，使超凈臺中的濕度維持在70-80%。
三、人結(jié)直腸癌類器官細(xì)胞懸浮液的配制
1. 24孔板中培養(yǎng)好的人結(jié)直腸癌類器官，小心地吸去孔中的培養(yǎng)基，不要破壞Matrigel dome。每孔加入400 μL TrypLE Express，室溫（15 – 25℃）孵育1分鐘。
2. 使用TrypLE Express預(yù)先濕潤1 mL的槍頭，上下吹打20次，吹散凝固的dome。
3. 37℃培養(yǎng)箱中孵育5-10分鐘。
4. 使用TrypLE Express預(yù)先濕潤1 mL的槍頭，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到15 mL的離心管中。
5. 以290×g，2 – 8℃下離心5分鐘，小心去除上清液。
6. 加入10 mL（2 – 8°C）冷的adDMEM/F12重懸細(xì)胞，再以200×g，2 – 8℃離心5分鐘，小心吸出上清的adDMEM/F12，不要接觸到細(xì)胞沉淀。
7.重新添加第2步中等體積的TrypLE Express，將細(xì)胞沉淀重懸，37℃培養(yǎng)箱中孵育5-10分鐘，至大部分類器官成為單細(xì)胞懸液。
8. 以290×g，2 – 8℃下離心5分鐘，小心去除上清液。
9. 加入10 mL（2 – 8°C）冷的adDMEM/F12重懸細(xì)胞，再以200×g，2 – 8℃離心5分鐘，小心吸出上清的adDMEM/F12，不要接觸到細(xì)胞沉淀。
10. 用adDMEM/F12重懸細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/mL。
四、打印接種人結(jié)直腸癌類器官
1. 打開打印機(jī)電源, 點(diǎn)擊設(shè)備歸零鍵。
2. 安裝打印頭，按照操作手冊進(jìn)行打印頭Priming。
3. 將第二步中預(yù)鋪基質(zhì)膠的孔板（本示例為96孔板）放置在打印機(jī)孔板支架上。
4. 使用移液器吸掉打印頭樣品槽中的無菌PBS，吸取30 μL細(xì)胞懸液，緩慢加入到打印頭的樣品槽中，進(jìn)行類器官打印，每孔打印2個(gè)循環(huán)（約500個(gè)細(xì)胞）。對照組，采用傳統(tǒng)膠滴法，每孔5 μL膠滴（約500個(gè)細(xì)胞）。
5. 將打印好類器官的孔板放入37℃培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)。
6. 向孔板中緩慢滴加類器官完全培養(yǎng)基，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)果如圖1所示。
圖1：人結(jié)直腸癌類器官打印培養(yǎng)結(jié)果
圖中標(biāo)尺為500 μm
五、類器官的免疫熒光染色
該法適合通過打印方式接種后培養(yǎng)的類器官。
1. 從孔中移除培養(yǎng)基，緩慢加入200 μL不含鈣鎂的PBS清洗，重復(fù)2次，避免破壞類器官結(jié)構(gòu)。
2. 吸去孔中的PBS，加入200 μL 4%PFA（多聚甲醛），4℃孵育45分鐘。
3. 吸去孔中的PFA，緩慢加入200 μL不含鈣鎂的PBS清洗，重復(fù)3次。
4. 吸去孔中的PBS，加入200 μL OWB（配置方法：1 mL Triton X-100，2 g BSA，用PBS定容至1 L），4℃封閉30分鐘。
5. 吸去孔中的OWB，加入100 μL 含有一抗的OWB，4℃過夜孵育。
6. 第二天，吸去孔中含一抗的OWB，加入200 μL OWB清洗，重復(fù)3次。
7. 吸去孔中的OWB，加入100 μL 含有二抗的OWB，室溫避光孵育1.5小時(shí)。
8. 吸去孔中含二抗的OWB，加入200 μL OWB清洗，重復(fù)3次。
9. 吸去孔中的OWB，加入含1×DAPI濃度的OWB，室溫避光孵育15分鐘。
10. 吸去孔中含DAPI的OWB，加入200 μL OWB清洗，重復(fù)2次。
11. 顯微鏡拍照，圖2是用PE公司的高內(nèi)涵拍攝的人結(jié)直腸癌類器官Ki67染色結(jié)果。
圖2：打印接種的人結(jié)直腸癌類器官
培養(yǎng)14天時(shí)的Ki67染色結(jié)果
標(biāo)尺為200 μm
圖3: 人結(jié)直腸癌類器官 綠色:Ki67,紅色: F-actin,藍(lán)色: 細(xì)胞核
圖（A）打印后直接固定染色
利用打印方式構(gòu)建類器官整體形態(tài)保存完整，染色背景清晰，操作更簡單
圖（B）膠滴法消化matrigel后固定染色
在消化matrigel的過程中容易發(fā)生類器官丟失或碎裂情況
BP4000 平臺產(chǎn)品概述
3D細(xì)胞球構(gòu)建平臺 BP4000
為傲睿科技自主研發(fā)的細(xì)胞球構(gòu)建自動化平臺，BP4000 通過整合液滴控制與精準(zhǔn)打印技術(shù)，為類器官培養(yǎng)提供了標(biāo)準(zhǔn)化解決方案。 該平臺以 “聚集打印 + 免消化檢測” 為核心設(shè)計(jì)理念，可在基質(zhì)膠（Matrigel）等 ECM 表面完成單細(xì)胞或細(xì)胞群落的定量接種，通過自動化程序構(gòu)建粒徑均一、空間分布可控的三維細(xì)胞陣列。從技術(shù)實(shí)現(xiàn)來看，其核心模塊包括高精度液滴生成系統(tǒng)、智能溫控培養(yǎng)單元及兼容多規(guī)格孔板的機(jī)械臂平臺，能夠滿足從基礎(chǔ)研究到高通量藥物篩選的全流程需求。
在類器官培養(yǎng)領(lǐng)域，BP4000的技術(shù)創(chuàng)新主要體現(xiàn)在兩大核心優(yōu)勢 —— 一方面通過聚集打印模式突破傳統(tǒng)培養(yǎng)中細(xì)胞增殖效率的瓶頸，另一方面以免消化染色技術(shù)重構(gòu)檢測流程，這些突破正通過人結(jié)直腸癌類器官等實(shí)踐案例得到充分驗(yàn)證。
01
優(yōu)勢一：突破細(xì)胞增殖分化效率的瓶頸
傳統(tǒng)類器官培養(yǎng)中，細(xì)胞分布不均、局部密度不足是制約增殖分化效率的關(guān)鍵因素。
BP4000采用先進(jìn)的聚集打印模式，通過精準(zhǔn)的液滴控制技術(shù)，將細(xì)胞以優(yōu)化的局部密度接種于基質(zhì)膠表面，形成標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞陣列。在人結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，BP4000每孔打印2個(gè)循環(huán)（約500個(gè)細(xì)胞）的聚集模式，與傳統(tǒng)膠滴法相比，顯著提升了細(xì)胞的空間聚集度。
這種高密度聚集打印帶來了驚人的生長效率提升。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，使用BP4000培養(yǎng)的結(jié)直腸癌類器官，其增殖分化速度較傳統(tǒng)方法大幅提高。從培養(yǎng)結(jié)果圖1可以清晰看到，打印組類器官在培養(yǎng)5-7天即可形成成熟結(jié)構(gòu)，而傳統(tǒng)膠滴法培養(yǎng)的類器官不僅生長周期更長，且結(jié)構(gòu)完整性和一致性也明顯遜色。
聚集打印形成的細(xì)胞微環(huán)境，有效促進(jìn)了細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)與物質(zhì)交換，為類器官的快速生長和功能分化提供了理想條件，這種高效的培養(yǎng)模式為后續(xù)的藥物篩選和機(jī)制研究贏得了寶貴時(shí)間。
02
優(yōu)勢二：優(yōu)化染色檢測
在類器官研究中，免疫熒光染色是分析細(xì)胞功能和分子表達(dá)的重要手段。傳統(tǒng)膠滴法培養(yǎng)的類器官在染色時(shí)，需要先溶解Matrigel基質(zhì)膠，這一過程常常導(dǎo)致類器官丟失或損傷，嚴(yán)重影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。BP4000技術(shù)徹底革新了這一流程，其打印的類器官可直接進(jìn)行免疫熒光染色，無需溶解Matrigel。這一創(chuàng)新帶來了多重優(yōu)勢。
首先，避免了Matrigel溶解過程對類器官結(jié)構(gòu)的破壞，從圖2和圖3可以直觀看到，打印組類器官整體形態(tài)保存完整，而膠滴法在消化Matrigel后容易發(fā)生類器官丟失或碎裂。
其次，直接染色操作更簡單，減少了實(shí)驗(yàn)步驟和時(shí)間成本。更重要的是，這種方法獲得的染色信號更強(qiáng)、背景更清晰，如圖2所示，打印接種的人結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)14天時(shí)的Ki67染色結(jié)果，細(xì)胞核、Ki67和F-actin的標(biāo)記清晰分明，為精確的定量分析提供了優(yōu)質(zhì)樣本。
BP4000的免消化染色技術(shù)，不僅提高了實(shí)驗(yàn)效率，更確保了檢測結(jié)果的真實(shí)性和可靠性，為類器官功能研究開辟了新路徑。
03
BP4000：讓類器官研究更加高效精準(zhǔn)
從聚集打印提升增殖分化效率，到免消化染色優(yōu)化檢測流程，BP4000細(xì)胞球構(gòu)建平臺在人結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)中展現(xiàn)出的技術(shù)優(yōu)勢，不僅解決了傳統(tǒng)方法的痛點(diǎn)，更推動了類器官研究向高效化、精準(zhǔn)化方向發(fā)展。
其標(biāo)準(zhǔn)化、自動化的操作模式，為大規(guī)模類器官庫的構(gòu)建和高通量藥物篩選提供了有力支撐，在腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療、新藥研發(fā)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新和完善，BP4000有望在更多類型類器官的培養(yǎng)和研究中發(fā)揮重要作用，為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究帶來更多突破。
我司專注于醫(yī)學(xué)研究、生物學(xué)研究及相關(guān)科研技術(shù)服務(wù)，可專業(yè)代為開展類器官培養(yǎng)服務(wù)，為科研機(jī)構(gòu)、醫(yī)療單位提供標(biāo)準(zhǔn)化、可溯源的實(shí)驗(yàn)支撐。 依托專業(yè)技術(shù)能力，我們可根據(jù)客戶需求定制類器官培養(yǎng)方案，全程嚴(yán)格把控實(shí)驗(yàn)流程，保障培養(yǎng)結(jié)果的穩(wěn)定性與可靠性，助力基因?qū)W研究、臨床試驗(yàn)、醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室等相關(guān)研究工作高效開展，為科研創(chuàng)新提供有力支持。
